Исследование применения культуральной жидкости бактерии lactobacillus sp. в консервации и обработке кукурузных зёрен

Технология сохранения семян сельскохозяйственных культур включает множество методов, но основными являются три: физический, химический и биологический. Однако сегодня все больше внимания уделяется биологическому методу сохранения благодаря его выдающимся преимуществам, таким как безопасность для пользователя, не влияющая на органолептические свойства сельскохозяйственной продукции после уборки.

ВВЕДЕНИЕ

Вещества, вырабатываемые лактобактериями, все больше применяются для сохранения пищевых продуктов благодаря их способности производить антимикробные соединения. Важность сохранения свежих продуктов, таких как мясо, рыба, яйца, молоко, овощи и фрукты, очевидна, но сохранение сельскохозяйственных семян также имеет важное значение в нашей жизни.

Кукуруза - одна из пяти важнейших зерновых культур Вьетнама.

Поскольку мы сосредоточились на количестве, качество еще не действительно хорошее, что ведет к низкому экспортному потенциалу кукурузы. Кукуруза очень подвержена заражению различными видами плесени, такими как Aspergillus spp., вызывающий гниение зерна, или Fusarium spp., вызывающий гниение стеблей и кочанов, или Helminthosporium spp., вызывающий пятнистость листьев на кукурузе. Fusarium spp. не только наносит ущерб кукурузе, влияя на способность прорастания, так как они производят токсины, такие как Zearelenone и Vomitoxin, но и влияют на дыхательную способность людей и животных при употреблении кукурузы, зараженной Fusarium spp.

Вместе с способностью к борьбе с различными видами грибковых заболеваний различные штаммы лактобактерий на зерне широко изучаются. У нас есть традиционные и промышленные продукты брожения, которые при использовании различных штаммов лактобактерий были доказаны как безопасные для потребителей, поэтому я считаю, что это актуальная проблема, и поэтому я выбираю проект: " Исследование применения культуральной жидкости бактерии Lactobacillus sp. в консервации и обработке кукурузных зёрен".

ОБЩИЙ ОБЗОР

Общая информация о грибах
- Введение

Грибы (Fungi, Mycota) - одно из пяти царств в системе классификации Р. Х. Уиттакера (1996). Грибы относятся к отделу грибов (Euphycophyta) и являются объектом изучения микологии (Mycology), это самостоятельная научная отрасль в области микробиологии. Однако некоторые группы грибов (дрожжи, плесени) из-за своего малого размера и необходимости применения микробиологических методов исследования рассматриваются как объект исследования в микробиологии. Грибы имеют много общего с растениями, но отличаются от них отсутствием фотосинтетических пигментов и слабой дифференциацией органов и тканей.

Грибы существуют и распространены во всех природных средах, таких как почва, вода, корни, стебли, листья, плоды и семена растений. Они могут производить токсины, вредные для людей, животных и растений. Однако грибы играют очень важную роль в разложении природных соединений, содержащих целлюлозу, протеины, липиды, хитин, пектин и т. д., обеспечивая замкнутый круг в природе.

Классификация грибов

Основываясь на морфологической структуре, грибы делятся на 4 основных класса:

Класс Phycomycetes (водорослевые грибы): Гифы без септ, споры состоят из двух подклассов: Oomycetes (нитчатые грибы) и Zygomycetes (соплевые грибы).

Класс Ascomycetes (мешковые грибы): Гифы с септами, асексуальное размножение с помощью аскоспор, сексуальное размножение происходит путем образования мешочков (аски) и мешковых спор (аскоспор).

Класс Basidiomycetes (базидиальные грибы): Сексуальное размножение происходит путем образования базидиоспор. Примеры таких грибов включают шампиньоны и шиитаке.

Класс Deuteromycetes (неполнокровные грибы): Отсутствует способность к сексуальному размножению, включает 3 подкласса.

Некоторые токсины и их вредные эффекты от плесени.

Токсины, вызываемые Fusarium spp.:
Фумонизины

Фумонизины включают в себя 6 различных токсинов (FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2). Они образуются Fusarium moniliforme, Fusarium proliferratum и Fus arium sp, особенно при влажном и умеренном климате. Фумонизины в основном обнаруживаются в кукурузе и продуктах из кукурузы, что делает эту проблему сложной во всем мире. Фумозин B1 является наиболее распространенным и часто встречающимся токсином в этой группе.

Токсичность

Фумонизин B1 - самый токсичный токсин, вызывает ряд симптомов, таких как:

Поражение мозга или печени.
Рак печени.
Рак пищевода у человека и повреждение печени, почек, сердца, легких, даже торможение роста и смерть.

Кроме того, люди страдают от ангины, вызванной отравлением пищи:

Ангина, вызванная отравлением пищи, обнаружена у людей, которые употребляли зерно, зараженное плесенью, или продукты из зерна, хранившиеся зимой на поле. Этот токсин часто вызывает смерть и известен под разными названиями: апластическая анемия, геморрагическая лейкопения, потеря лейкоцитов, инфекционное воспаление горла, пищевое отравление, миелотоксическое отравление.

Зеараленон

Зеараленон (ZON) - единственный продукт плесени Fusarium, развивающейся при высокой влажности (например, Fusarium roseum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum). Он обладает аналогичным действием женских половых гормонов и вызывает псевдосексуальную активность (симптомы, аналогичные половому возбуждению). Считается, что свиньи являются наиболее чувствительными животными.

Трихотецены

Трихотецены представляют собой группу из 150 соединений с похожей структурой, в основном производимых Fusarium spp, широко распространенного вида плесени в зерне по всему миру.

Исходя из химических свойств и формирования плесени, их можно разделить на 4 основных группы, с типами A и B, негативно влияющими на скотоводство. Трихотецены типа A (в основном производятся Fusanum sporotrichioides) включают различные типы токсинов: токсин T-2, токсин HT-2, неосоланиол (NEO) и диацетоксисцирпенол (DAS). Трихотецены типа B (в основном производятся Fusariltm culmorumи F.graminearum) включают виды деоксиниваленола и 3-ацетил, а также 15 производных этих соединений. •

Токсичность:

Токсин T-2 ингибирует синтез белка и ослабляет созревание кровяных клеток в костном мозге, а также блокирует иммунную систему.

Нарушает функцию рибосом, подавляет синтез белка в рибосомах.

Причиняет повреждения слизистой желудка и кишечника, что приводит к массовому кровоизлиянию и воспалению слизистой желудка.

При употреблении большого количества токсина в пищу вызывает рвоту и анорексию.

Рисунок 1. Химическая структура трихотеценов и детоксифицированных соединений

Методы ограничения отравления трихотеценами:

Трихотецены устойчивы к воздействию окружающей среды и термостабильны, не разлагаются при температуре ниже 2300°C, токсин устойчив в атмосфере и свете на протяжении недели.

Трихотецены могут быть полностью обработаны при 6000°C в течение 10 минут в растворе NaOH.

Трихотецены могут быть легко удалены из большинства воды.

Трихотецены теряют активность при взаимодействии с некоторыми агентами, такими как бентонит и белая глина.

Трихотецены инактивируются в 3-5% растворе NaHSO₃.

Fusarium spp.

Поскольку в теме исследования используются виды Fusarium spp., описывается довольно полное представление об этом виде грибов:

Характеристика грибов Fusarium spp.

Fusarium spp - самый крупный род семейства Tuberculariaceae, они являются патогенными или паразитическими на разных частях растений, таких как корни, стебли и зерна. Они конкурируют за питание, развивают мицелий, покрывающий сосудистую ткань стебля, или выделяют токсины в сосуды, что влияет на прорастание семян или увядание растений.

Классификация:

Грибы Fusarium spp. относятся к:

Отдел: Ascomycota

Класс: Deuteromycetes Семейство: Tuberaulariaceae Порядок: Moniliales

Род: Fusarium

Род Fusarium включает множество видов, вызывающих болезни у растений, таких как увядание из-за закупорки сосудов, гниение корней, стеблей и кочанов, гниение шейки корня молодых растений. Некоторые виды- возбудители болезней также производят микотоксины, смешанные с зерновыми культурами.

Fusarium spp. - типичный гриб, встречающийся в почве, иногда на семенах и стеблях растений, а так же на материалах с содержанием целлюлозы.

Оптимальная температура для развития Fusarium spp. составляет 25-30°C. Грибы Fusarium, как и другие виды грибов, активно развиваются в среде

PDA при температуре 25°C. Верхняя поверхность колонии грибов может быть белой, желтой, оранжевой, красной или фиолетовой. Нижняя поверхность колонии грибов может быть бесцветной, бледно-желтой или коричневой.

Исследования Fusarium начались в 1809 году, но определение количества видов оказалось очень сложным из-за их большого числа. Существует более 70 видов и более 55 подвидов, согласно Gerlach и Nirenberg (1982).

Токсины грибов:

Некоторые важные группы токсинов, производимых грибами Fusarium, включают фумонизины (фумонизин B1, фумонизин B2, фумонизин B3). В результате исследований авторов Марасас ВФО, Миллер Дж.Д., Райли Р.Т., Висконти А. (2001b); Нельсон П.Е., Десжардин А.Е., Платтнер Р.Д. (1993) было доказано, что они вызывают энцефаломаляцию лошадей (Equine leucoencephalomalacia), рак печени у мышей и синдром отека легких у свиней. В эпидемиологических исследованиях группы авторов Марасас ВФО, Нельсон П.Е., Туссун Т.А. (1984) также обнаружено, что фумонизины связаны с раком пищевода у людей.

Некоторые виды токсинов, такие как фусариновая кислота, 5-(бутил)-2- пиридинкарбоновая кислота, являются одними из самых распространенных токсинов, производимых некоторыми видами грибов Fusarium, такими как Fusarium verticiloides (Sacc.) Nirenberg, Fusarium subglutinans (Matsush) Nirenberg, Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum (Matsush) Nirenberg. Фусариновая кислота оказывает большое химическое воздействие на нервную систему и может влиять на размножение, рост и активность животных.

Другой вид токсина - монилиформин - очень токсичен и производится некоторыми видами грибов Fusarium, такими как Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum, Fusarium semitectum, Fusarium subglutinans. Этот токсин может быть найден в природе, как в корме, так и в продуктах, используемых в качестве корма. В других исследованиях группы авторов Марасас ВФО, Миллер Дж.Д., Райли Р.Т., Висконти А. (2001) показано, что токсин деоксиниваленол, производимый некоторыми видами грибов, вызывающих вред на зерновых культурах, такими как Fusarium graminearum и Fusarium culmorum, и другими видами, является одним из самых сильных токсинов при контакте с человеческим организмом. Зеараленон - другой токсин грибов Fusarium, который может вызывать бесплодие у животных, обнаружен на многих сельскохозяйственных культурах. Зеараленон производится видами грибов F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti и F. crookwellens.

Различные виды сельскохозяйственной продукции Вьетнама, такие как рис, кофе, перец, кешью, питайя, саподилла, становятся все более известными в мире. Только по кофе Вьетнам сейчас занимает одно из лидирующих мест в мире по урожайности, составляющей около 8-10 тонн/га. Для достижения такой урожайности фермерам приходится использовать до 2 тонн мочевины на 1 га, а также множество других химических удобрений и немало пестицидов. В результате не только фермеры тратят много денег на химикаты, но и микроорганизмы почвы и качество почвы серьезно страдают. Биологические методы для растений рекомендуются учеными из-за следующих преимуществ:

Не наносит отрицательного воздействия на здоровье людей, животных и растений, в отличие от химических средств защиты растений.
Сохраняет баланс экосистемы в почве в частности и окружающей среде в целом.
Не разрушает почву, а также способствует увеличению ее плодородия.
Улучшает усвоение питательных веществ растениями, способствуя повышению урожайности и качества продукции.
Уничтожает вредных насекомых, снижает заболеваемость растений и повышает их иммунитет без негативного воздействия на окружающую среду, в отличие от химических средств защиты растений. Биологические препараты действуют медленнее, чем химические, но их эффект продолжительнее.

Способны разлагать и преобразовывать биологические отходы, сельскохозяйственные и промышленные отходы, способствуя очистке окружающей среды.
Токсичные виды грибов не смогут развить механизмы сопротивления.

Таблица 1.

Некоторые виды грибов и их токсины

Основные виды

микотоксинов

Виды грибков

Токсины грибов

Aspergillus spp.

A. flavus

A. parasiticus

A. nomius

A. pseudotamarii

Aflatoxin

(B1, B2, G1, G2)

A. ochraceus

Ochratoxin

(Ochratoxin A)

A. clavatus

A. terreus

Patulin

A. flavus

A. ben

Acid Cyclopiazonic (CPA)

Claviceps spp.

C. purpurea

C. fusiformis

C. paspali

C. africana

Один Penitrem Ergot alkaloids:

Clavines (Argroclavine)

Aсid lysergic

Amids lysergic acid (Ergin)

Ergopeptines(Ergotamine, Ergovaline)

Fusarium spp.

F. verticillioides (Syn.

F. moniliforme)

F. proliferatum

Fumonisin (B1, B2, B3) Acid fusaric

F. graminearum

F. avenaceum

F. culmorum

Type A Trichothecenes: T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxyscirpenol (DAS)

F. poae

F. equiseti

F. crookwellense

F. acuminatum

F. sambucinum

F. sporotrichioides

Type B Trichothecenes: Nivalenol, deoxynivalenol(DON), fusarenon-X

F. graminearum

F. culmorum

Zearalenone

F. sporotrichioides

Penicillium spp.

P. verrucosum

P. viridicatum

Ochratoxin

(Ochratoxin A)

P. citrinum

P. verrucosum

Citrinin

P. roqueforti

Roquefortine PR toxin

Penitrem A

P. cyclopium

P. camemberti

Axit Cyclopiazonic (CPA)

Penitrem A

P. expansum

P. claviforme

P. roquefortii

Patulin

Neotyphodium spp. (Ранее Acremonium))

N. coenophialum

Высокотоксичные райграс: Ergot

alkaloids, lolines, peramine

N. lolii

Высокотоксичные райграс:

Lolitrems, peramine, ergot alkaloid (ergovaline)

Pithomyces spp.

P. chartarum

Sporidesmin

Обзор лактобактерий
- Общие характеристики
  - Морфология и питание лактобактерий

Лактобактерии (Lactic acid bacteria) - грамположительные, кислотоустойчивые бактерии, не образующие спор, неподвижные, представленные палочковидными или сферическими формами. Лактобактерии лучше всего развиваются при pH 5,5-5,8 и имеют сложные питательные потребности, такие как аминокислоты, пептиды, витамины, минералы, жирные кислоты и углеводы.

Молочнокислые бактерии широко используются в производстве броженых продуктов, таких как йогурт, сыр и др. Кроме того, они производят некоторые соединения с антибактериальной активностью, такие как бактериоцины, которые применяются для консервации пищевых продуктов путем ингибирования развития вредных бактерий.

Наиболее распространенными видами молочнокислыми бактериями являются Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Camobacterium, Enterococcus, Oenococcus. В зависимости от формы клеток, лактобактерии делятся на сферические и палочковидные формы, диаметр сферических бактерий варьируется от 0,5 до 1,5 мкм. Сферические клетки обычно располагаются парами или формируют цепочки разной длины. Размеры клеток лактобактерий составляют от 1 до 8 мкм. Они могут находиться отдельно или объединяться в цепочки или группы.

Потребности в питательных веществах молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии - микроорганизмы с высокими потребностями в питательных веществах. Различные виды молочнокислых бактерий имеют разные потребности в питательных веществах:

Потребности в углеродных источниках: Молочнокислые бактерии могут использовать множество углеводов от моносахаридов (глюкоза, фруктоза) и дисахаридов (сахароза, лактоза, мальтоза) до полисахаридов (крахмал, декстрин). Они используют эти источники углерода для обеспечения энергии, создания клеточных структур и сырья для процесса ферментации, образующей органические кислоты, такие как цитратная, молочная, пировиноградная, фумаровая, уксусная кислоты.
Потребности в азотных источниках: Разные виды бактерий имеют разные потребности в азотных источниках. Большинство молочнокислых бактерий не могут синтезировать сложные органические вещества, содержащие азот. Поэтому для обеспечения роста и развития им необходимо использовать доступные азотные источники в окружающей среде. Молочнокислые бактерии могут использовать такие азотные источники, как мясной экстракт, дрожжевой экстракт, триптон, гидролизат казеина из молока, соевый пептон.

Потребности в витаминах: Витамины играют роль когерентных веществ в клеточном обмене веществ, поэтому они необходимы для жизнедеятельности. Однако большинство видов молочнокислых бактерий не могут синтезировать витамины. Поэтому необходимо добавлять различные витамины в среду.
Потребности в других органических веществах: Помимо аминокислот и витаминов, молочнокислые бактерии также нуждаются в других органических соединениях для роста, таких как азотистые основания или органические кислоты. Некоторые органические кислоты благоприятно влияют на скорость роста молочнокислых бактерий, такие как цитратная и олеиновая кислоты. В настоящее время используются цитратные соли и производные олеиновой кислоты в качестве компонентов среды для культивирования, изоляции и сохранения штаммов молочнокислых бактерий.
Потребности в других неорганических солях: Для обеспечения полного роста и развития молочнокислым бактериям требуются неорганические соли. Целью является предоставление минеральных элементов, таких как медь, железо, натрий, калий, фосфор, сера, магний, марганец. Особенно важны магний и марганец, так как они участвуют и обеспечивают функционирование ферментов, предотвращают саморазрушение и стабилизируют клеточные структуры.
Потребности в кислороде: Молочнокислые бактерии могут жить в окружающей среде с кислородом или без кислорода. Однако в аэробных условиях биомасса бактерий развивается быстрее, чем в анаэробных условиях.

Классификация молочнокислых бактерий Молочнокислые бактерии делятся на две группы на основе способности к брожению:

Гомолактическое брожение: Производят более 85% молочной кислоты из глюкозы.

При избытке глюкозы и ограничении кислорода, молочнокислые бактерии превращают молекулу глюкозы по пути Эмбдена-Мейерхофа- Парнаса в 2 молекулы пирувата. При избытке глюкозы и ограничении кислорода, молочнокислые бактерии превращают одну молекулу глюкозы по пути Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса в две молекулы пирувата. Внутриклеточное окислительно-восстановительное равновесие поддерживается на протяжении всего процесса окисления NADH с одновременным восстановлением пирувата в молочную кислоту. В результате этого процесса образуется 2 молекулы ATP на каждый использованный глюкозу. Представителями этого типа брожения являются Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus и Lactobacillus группа I.

Гетеролактическое брожение: Производят только 50% молочной кислоты и некоторое количество этанола, уксусной кислоты и CO₂.

Молочнокислые бактерии с гетеролактическим брожением расщепляют глюкозу по пентозофосфатному пути. Одна молекула глюкозо-6-фосфата вначале гидрируется до 6-фосфоглюконата, а затем отщепляется карбоксильная группа с образованием одной молекулы CO2. В результате пентозо-5-фосфат распадается на глицеральдегид-3-фосфат (GAP) и одну молекулу ацетил-фосфата. Затем GAP превращается в лактат, как в гомолактическом брожении, а ацетил-фосфат превращается в этанол через промежуточные соединения: ацетил-КоА и ацетальдегид. Теоретически, конечный продукт (включая ATP) производится в том же количестве, что и при распаде одной молекулы глюкозы. Обязательные гетеролактические молочнокислых бактерий включают Leuconostoc, Oenococcus, Weissella и Lactobacillus группа III.

Таблица 2. Некоторые метаболические продукты молочнокислымиы бактерий и механизмы их действия.

Продукты метаболизма	Механизм действия
1. Углекислый газ	Предотвращение восстановления карбоксильной группы, уменьшение проницаемости мембраны
2. Диацетил	Реакция с аргининсвязывающими белками
3. Перекись водорода Лактопероксидаза	Окисление основных белков
4. Молочная кислота	Лактат ионизируется и проходит через мембрану, снижая внутриклеточное pH. Это препятствует процессам метаболизма, таким как окислительное восстановление фосфора.
5. Бактериоцин	Влияние на мембрану, синтез белка и ДНК.

Синтез антибактериальных соединений молочнокислых бактерий
- Бактериоцины

Бактериоцины - это биологически активные протеины, вырабатываемые бактериями, которые могут уничтожать или подавлять рост других родственных бактерий. Бактериоцины обладают антибактериальной активностью, вырабатываются разнообразными группами бактерий и могут различаться по механизмам и спектру действия, молекулярной массе, биохимическим свойствам и генетическому происхождению (Klaenhamme, 1993).

Бактериоцины по своей природе являются антибактериальными пептидами, производимыми для борьбы с другими бактериями. Бактерии, производящие определенный вид бактериоцина, имеют способность противостоять этому бактериоцину. Сами продуцирующие клетки иммунны к действию бактериоцина. Бактериоцины образуются у грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, однако бактериоцины от молочнокислых бактерий исследуются наиболее активно из-за их эффективности, безопасности и потенциала применения в качестве природных консервантов в пищевой промышленности.

Бактериоцины не являются антибиотиками, так как они являются пептидами, синтезируемыми рибосомами бактерий, а не вторичными метаболитами, и быстро расщепляются протеазами пищеварительной системы человека. Преимуществом бактериоцинов является высокая антибактериальная активность, даже при очень низких концентрациях. Однако бактериоцины обычно имеют узкий спектр антибактериальной активности по сравнению с антибиотиками. В отличие от антибиотиков, бактериоцины обычно используются в продуктах питания и не оказывают токсического воздействия на клетки ядра, в то время как антибиотики используются только в медицине и могут оказывать токсическое воздействие на клетки ядра. В мире бактериоцины производятся с использованием ферментационных биотехнологий молочнокислых бактерий.

Классификация бактериоцинов

На сегодняшний день известно около 200 видов бактериоцинов, однако их классификация до сих пор не определена точно. Бактериоцины классифицируются по различным критериям, таким как семейство производящих бактерий, молекулярная масса и последовательность аминокислот. Бактериоцины делятся на 4 группы, среди которых группы 1 и 2 наиболее разнообразны и имеют большой коммерческий потенциал.

4 группы включают:

Группа 1: (лантибиотики) представляют собой малые молекулы (<5 кДа). Лантибиотики содержат редкие аминокислоты (например, лантионин и 3- метиллантионин) и некоторые аминокислоты, обезвоженные. Лантибиотики могут быть разделены на два подкласса на основе структурных и функциональных характеристик:

Подкласс 1a: это положительно заряженные пептидные молекулы, содержащие 34 аминокислоты. Эти пептиды в основном действуют, нарушая целостность мембраны клеток-мишеней. Лантибиотики могут быть разделены на две подгруппы на основе размера, заряда и последовательности пептидов- предшественников (leader peptide).

Подкласс 1b: это сферические пептидные молекулы, содержащие до 19 аминокислот. Основное действие этих пептидов заключается в нарушении функции ферментов.

Лантибиотики образуются в неактивном состоянии с последовательностью лидер-пептида на N-конце, которая будет удалена в процессе созревания для высвобождения активированной пептидной молекулы. Группа 2: Это малые бактериоцинные молекулы (<10 кДа), обычно представляющие собой пептиды, действующие на клеточные мембраны, не содержащие лантионина и устойчивые к высоким температурам. Бактериоцины группы 2 имеют узкий спектр антибактериальной активности. Группа 2 делится

на 3 подгруппы:

Подгруппа 2a: бактериоцины этой группы очень разнообразны, характерной чертой является сохранение последовательности (YGNGVXC) на N-конце и активность против Listeria.
Подгруппа 2b: эти бактериоцины требуют комбинации двух или более пептидов для полноценной антибактериальной активности. В большинстве случаев отдельные пептиды также проявляют бактериоцинную активность, но активность повышается при наличии второго пептида.
Подгруппа 2c: сек-зависимые бактериоцины. Молекулы бактериоцинов этой группы выведены из клетки через цитоплазматическую мембрану по пути секреции, зависящей от секреторного фактора.

Бактериоцины группы 2a имеют потенциал для промышленного использования из-за своей высокой активности против Listeria, иногда они вызывают больше интереса, чем бактериоцины группы 1 (нисин), поскольку они имеют узкий спектр антибактериальной активности и не уничтожают стартерные культуры. Pediocin PA-1 является классическим примером и наиболее изученным среди бактериоцинов группы 2a.

Группа 3: Бактериоцины группы 3 представляют собой крупные белковые молекулы (> 30 кДа) и устойчивы к высоким температурам. Эта группа включает экстрацеллюлярные ферменты (гемолизины и мурамидазы) с физиологической

активностью бактериоцинов. Бактериоцины группы 3 получены из некоторых штаммов Lactobacillus. Только несколько бактериоцинов этой группы были идентифицированы (например, Helveticin, Helveticin V). (Parada J. L. и др., 2007). Группа 4: Это сложные бактериоцины, которые помимо белковых субъединиц содержат также липиды и углеводы. В настоящее время о структуре и функции бактериоцинов этой группы известно немного, поскольку чистых молекул этой группы еще не было получено. Бактериоцины группы 4 являются результатом взаимодействия гидрофобности и положительного заряда бактериоцинов с другими молекулами в сыром экстракте. Эта группа включает

гликопротеины и липопротеины. (Klaenhammer, 1988, 1993).

Применение бактериоцинов

Ферментация продуктов с использованием защитных штаммов (обычно молочнокислых бактерий) для производства бактериоцинов. В этом случае, способность молочнокислые бактерий расти и производить бактериоцины в продукте является решающей.

Добавление очищенных или полуочищенных бактериоцинов в качестве консервантов для продуктов.

Использование предварительно сброженного продукта с бактериоцин- продуцирующим штаммом в качестве ингредиента в процессе производства продуктов.

Новый подход на основе второго варианта - использование бактериоцин- активированных полиэтиленовых мембран для упаковки продуктов.

Противогрибковая активность молочнокислых бактерий и ее применение
- Противогрибковая активность молочнокислых бактерий

Противогрибковая активность молочнокислых бактерий связана с подавлением других микроорганизмов, вызванным конкуренцией за питательные вещества и выработкой антибиотиков (Holzapfel, 1995). Противогрибковая активность и ингибирующие компоненты были обнаружены и определены во многих исследованиях. Противогрибковая активность L. coryniformis стабильна при высоких температурах и pH 3 – 4,5 (Magnusson и Schnurer, 2001).

Большинство исследований противогрибковой активности молочнокислых бактерий связано с продукцией антигрибковых белков или белковых соединений, и некоторые молочнокислые бактерии, такие как L. plantarum и L. sanfrancisco, специально производят органические кислоты с противогрибковыми свойствами (Corsetti и др., 1998). В настоящее время единственным биопротекторным соединением, которое может быть добавлено в продукты молочнокислых бактерий, является низин (Gardiner и др., 2000; Corcoran и др., 2004.).

Лактобактерии способны производить большое количество продуктов с кислотными свойствами и других соединений с сильной антимикотической активностью. Большинство определенных антимикотических веществ имеют низкую молекулярную массу, включая органические кислоты, H₂O₂, белковые соединения и гидроксильные жирные кислоты.

Применение лактобактерий

Благодаря способности производить молочную кислоту из различных источников углеводов и антимикробной активности против многих вредных микроорганизмов, лактобактерии широко используются в традиционных ферментационных технологиях и все больше применяются в различных областях, таких как:

Пищевые продукты: они помогают снизить использование химических веществ, а также температурную обработку, могут заменить пищевые консерванты, сохраняя при этом натуральное состояние продукта после хранения, и обеспечивают органолептические и питательные свойства продукта, удовлетворяя возрастающий спрос на безопасность, свежесть, готовые к употреблению продукты, минимально обработанные продукты и увеличение продуктов с новыми органолептическими свойствами, такими как уменьшение кислотности или концентрации соли (De Vuyst, Leroy, 2007).

Промышленность: лактобактерии являются источником ферментации для производства молочной кислоты, которая приносит доход в миллиарды долларов, так как она широко используется во многих областях.
Медицина: лечение кишечных заболеваний, улучшение пищеварительной системы...
Сельское хозяйство и окружающая среда: лактобактерии ограничивают развитие грибков Fusarium spp., препараты EM играют роль в улучшении почвы и не загрязняют окружающую среду.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы исследования
- Материалы: Молочнокислого бактерии Lactobacillus sp. Гриб Fusarium
- Химические реагенты и используемая среда:
  - Химические реагенты:

Химические реагенты, используемые для приготовления среды MRS Broth, улучшенного MRS и PDA.

Химические реагенты, используемые для приготовления различных реагентов: реагент Луголя, реагент бромфенолового синего (BPB), реагент фенолфталеина. NaOH 0,1N, NaOH 2N).

Спирт 96°, 70°. Дистиллированная вода.

Carbendazim 500FL с концентрацией 0,15%.

Среда выращивания:

Среда MRS Broth, улучшенный MRS agar для выращивания молочнокислых бактерий.

Среда PDA для выращивания плесеневых культур.

Оборудование и инструменты:
- Оборудование:

Ламинарный бокс Термостат

Холодильник -20^oC, -5 ^oC Сушильный шкаф Спектрофотометр Автоклав Аналитические весы Индукционная плита Термометр

Дистиллятор Водяная баня

Инструменты:

Пробирки, пластиковые и стеклянные петриевские чашки, колбы, стеклянные стаканы, мерные бутылки, мерные цилиндры, стеклянные палочки.

Стеклянные пипетки 5мл, 10мл, 20мл, микропипетка 100-1000мкл. Инокуляционные палочки, стерильные палочки, зажимы для агара,

палочки для прокола агара, спиртовая лампа, скальпель, эппендорф 1мл.

Влагопоглощающий ватный тампон, водонепроницаемый ватный тампон, фильтровальная бумага, подставка для пробирок.

Методика:
- Цель работы:

Исследование возможности применения выращиваемой среды бактерии Lactobacillus sp. для сохранения качества зерна кукурузы и влияние выращиваемой среды на прорастание зерна.

Содержание:

Активация Lactobacillus sp. и Fusarium sp.

Исследование морфологических и биохимических характеристик

Lactobacillus sp. и Fusarium sp.

Исследование прямого антагонистического действия Lactobacillus sp. на грибковый Fusarium sp.

Исследование антагонистической активности выращиваемой среды бактерии Lactobacillus sp после нагревания при температура 65°C, 80°C, 100°C в течение 15 минут.

Исследование процента прорастания семян после замачивания в выращиваемой среде через 30 минут после инокуляции грибка при нагревании при температурах 65°C, 80°C, 100°C в течение 15 минут и без нагревания.

Применение выращиваемой среды бактерии Lactobacillus sp. для сохранения качества зерна кукурузы и прорастания семян после уборки.

Методы исследования:
- Исследование морфологии бактерий

Процесс объяснения:

Цель: Подтвердить чистоту штамма молочнокислых бактерий, провести ряд биохимических реакций

Молочнокислые бактерии могут ослабевать и инфицироваться другими видами бактерий в процессе хранения. Поэтому, я проводу этот эксперимент с целью подтверждения чистоты молочнокислого штамма и его активации для последующих экспериментов.

Lactobacillus sp. размножается в среде MRS Broth и инкубируется при 37°C в течение 24 часов. Затем проводится пересадка на MRS Agar и инкубация в течение 24 часов при 37°C, после чего изучается морфология и характеристики культивирования бактерий.

Грам окрашивание

Цель: Определение бактерий грам-положительные или грам- отрицательные.

Методика: Основано на улучшенном методе Hucker с использованием 24- часовой культуры.

Подготовка смаза: Используйте стерильную петлю для сбора небольшого количества бактерий с агара (после 24 часов инкубации) и разведите 1 каплю дистиллированной воды на стекле, высушите на воздухе.

Фиксация клеток: Прокаливание смаза на пламени спиртовки 2-3 раза.

Окрашивание с использованием раствора кристаллического фиолетового цвета в течение 1 минуты, затем промывание водой и промокание.

Повторное окрашивание с использованием раствора Lugol в течение 1 минуты, промывание водой и промокание.

Нанесение разбавителя, удерживание около 30 секунд (до момента потери цвета), затем промывание водой и промокание.

Дополнительное окрашивание с использованием раствора Safarin в течение 2-3 минут, промывание водой и высыхание на воздухе.

Осмотр стекла: Используйте х100 масляный объектив для наблюдения.

Результат: Грам-положительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грам-отрицательные – в розовый.

Окрашивание спор

Цель: Исключить наличие спорообразующих бактерий, таких как Bacillus spp. и Clostridium spp., так как Lactobacillus sp. не образует спор, и споры и вегетативные клетки окрашиваются в разные цвета.

Методика: Метод Schaeffer-Fulton.

Шаг 1: Подготовка смаза и фиксация образца

С использованием стерильной петли возьмим небольшое количество бактерий из наклонной агаровой пробирки (или подозрительного образца) и разведим в 1 капле дистиллированной воды на стекле, затем высушим на воздухе и прокаливайте на пламени спиртовки 2-3 раза для фиксации бактерий на стекле.

Фиксируйте смаз, нанеся 1-2 капли 96% спирта. Сожгим в течение 10 секунд и немедленно тушите.

Поместим образец на подставку, подставка должна быть помещена на стеклянную чашу с небольшим количеством кипяченой воды (85-90°C) на плите. Шаг 2: Окрашивание образца

Поместим фильтровальную бумагу на мазок.

Наносим 2-3 капли 5% раствора малахитового зеленого на мазок и обработаем паром горячей воды в течение 5-10 минут. Если окрашенная бумага высохла, добавьтим еще.

Промываем мазок водой в течение 30 секунд (в это время вегетативные клетки потеряют цвет, а споры сохранят свой цвет).

Поместим образец на подставку, подставка должна быть помещена на стеклянную чашу с водой.

Поместим фильтровальную бумагу на мазок.

Наносим 2-3 капли раствора сафранина или фуксина на фильтровальную бумагу и оставляем на 30 секунд.

Промываем водой и промокним или оставьте смаз высохнуть на воздухе. Шаг 3: Осмотр образца под оптическим микроскопом с масляным объективом (x100 ).

Результаты: При правильной окраске споры будут окрашены в зеленовато- голубой цвет, а вегетативные клетки - в розово-красный цвет.

Примечание: Для упрощения наблюдения спор следует выращивать бактерии на питательной среде, содержащей 0,005% MnCl₂ (5 мг/л) за 2 недели до эксперимента на наклонном агаре. Можно заменить 5% раствор малахитового зеленого на 6% раствор метиленового синего.

Тест на подвижность

Цель: Определить способность микроорганизма перемещаться в мягкой агаровой среде с концентрацией агара 0,5-0,7%.

Так как лактобациллы не обладают подвижностью и растут только вдоль вертикальной линии засеивания в пробирке с мягкой агаровой средой, не замутняя среду вокруг, этот тест позволяет исключить подвижные бактерии, которые не являются лактобациллами, и распространяются за пределами линии засеивания, замутняя среду вокруг.

Проведение:

-Используем петлю для засева и вонзим ее вертикально в мягкую агаровую среду, не касаясь дна пробирки.

-Установим пробирки вертикально, инкубируем при 37°C и наблюдайте через 1- 3 дня.

Результаты: Если бактерии растут и распространяются вокруг линии засева, это означает, что они обладают подвижностью. Если бактерии растут только вдоль линии засева, это означает, что они неподвижны.

Тест на каталазу

Цель: Определить способность бактерий продуцировать фермент каталазу. Проведение: Капним прямо на 18-24-часовую культуру бактерий раствор

H₂O₂ и наблюдайте результат.

Результаты: Бактерии способны продуцировать фермент каталазу, если появляются пузырьки газа быстро и сильно, отрицательный результат - если ничего не происходит.

Общее содержание кислоты

Цель: Определить общее содержание кислоты методом, основанным на молочной кислоте, чтобы определить количество молочной кислоты, произведенной испытуемым штаммом молочнокислых бактерий. Количество кислоты в броженом растворе может быть определено с помощью стандартного щелочного раствора благодаря изменению цвета раствора индикатора фенолфталеина.

Проведение: В коническую колбу добавим 10 мл броженного раствора с бактериальной культурой, добавим 2-3 капли фенолфталеина и титруем стандартным раствором NaOH 0,1N до появления бледно-розового цвета. Используем pH-метр для титрования до pH 8,0 и запишим результат.

Результаты: Общее содержание кислоты, выраженное в молочной кислоте, рассчитывается следующим образом:

V1 × K

% Молочной кислоты =

где V₁ - объем NaOH 0,1N, использованный для титрования (мл);

K - коэффициент перевода в соответствующую кислоту, длямолочной кислоты равен 0,009;

V₂ - объем культуральной жидкости, использованный для титрования (мл).

2.6.1.6. Тест на способность ферментации сахаров

Цель: Проверить способность бактерий ферментировать различные виды сахаров.

Проведение: В среде MRS-Broth последовательно заменим глюкозу на сахарозу, мальтозу и ксилозу. Затем поместим в пробирки с дурхамской трубкой, стерилизуем и засеем бактериями, инкубируем при 37°C в течение 24 часов и наблюдаем.

Результаты: Положительный результат - когда среда становится мутной, меняет цвет на желтый и газ образуется или не образуется в дурхамской трубке. Отрицательный результат - когда среда остается прозрачной, без газа.

Тест на протеазы

Цель: Определить способность вырабатывать протеазы, разлагающие субстрат казеин.

Проведение: Приготовим Petri-чашки с MRS-средой, содержащей 1% казеина, стерилизуем. Сделаем отверстия в агаре и поместите культурную жидкость молочнокислых бактерий в отверстия. Инкубируем при 37°C в течение 24-48 часов и измерьте диаметр зоны разложения.

Результаты: Бактерии способны разлагать казеин, если вокруг отверстия образуется зона разложения; если нет, среда вокруг отверстия остается мутной.

Тест на хитиназу:

Цель: Определить способность бактерий вырабатывать фермент хитиназу, разлагающий хитин.

Проведение: Приготовим Petri-чашки с средой, содержащей 1% суспензии хитина и 2% агара, стерилизуем. Сделаем отверстия в агаре и поместите культурную жидкость молочнокислых бактерий в отверстия. Инкубируем при 37°C в течение 24-48 часов, затем добавим реактив Люголя и измерим диаметр зоны разложения.

Результаты: Бактерии способны синтезировать фермент хитиназу, если вокруг отверстия образуется светлое прозрачное кольцо, которое не окрашивается реактивом Люголя. Если такого кольца не образуется, это указывает на то, что бактерии не обладают способностью синтезировать хитиназу.

Исследование прямой антагонистической активности Lactobacillus sp. против Fusarium sp.

Штамм лактобацилл культивируется в среде MRS Broth при 37°C в течение 24 часов, отношение инокуляции составляет 5%.

Исследуем антигрибковую активность.

Используемая среда - модифицированный MRS Agar, на который наносятся две линии на расстоянии 1,5 см от края тарелки.

Штамм гриба культивируется в среде PDB при 25-30°C в течение 24 часов, затем инокулируется на питательную среду PDA.

С помощью петли вырежим грибной агар диаметром 0,5 см и поместите его в центр тарелки. Инкубируем при 25- 30°C в течение 24 часов.

Используем петлю для нанесения штрихов на две предварительно нанесенные линии на тарелке с модифицированным MRS Agar, содержащим грибной агар. На контрольной тарелке без штрихов (отрицательный контроль) и положительный контроль с нанесением штрихов Carbendazim с концентрацией 150 мкл в 100 мл дистиллированной воды, а также контроль с нанесением штрихов культуральной среды.

Повторим каждый эксперимент 3 раза и инкубируем при 37°C в течение 72 часов. Затем измерим диаметр колонии грибов и рассчитаем процент антигрибковой активности.

Формула для расчета процентного соотношения антимикотической активности (%):

Процент антимикотической активности (%) =^D^{контроль} ⁻ ^D^{эксперимент} × 100%

Dконтроль

где D_{контроль} - диаметр колонии грибов на контрольной тарелке (мм).

D_{эксперимент} - диаметр колонии грибов на экспериментальной тарелке (мм).

2.4.3 Исследование влияние бактерий Lactobacillus sp. на силу прорастания кукурузы

Цель: Исследовать рост и развитие кукурузы в условиях лаборатории.

Методика: Результаты исследования силы прорастания определяются по формуле (Abdul Baki and Anderson, 1973):

Сила прорастания = (Средняя длина корня + средняя длина побега) х прорастания семян (%).

Исследование влияния культуральной жидкости Lactobacillus sp. на прорастание семян кукурузы.

Lactobacillus sp. выращивается в MRS Broth при 37°C в течение 24 часов, концентрация инокуляции составляет 5%.

Культуральная жидкость нейтрализуется до pH=6 с использованием 1N NaOH и без нейтрализации:

Нейтрализованная часть

Нагревание до 100°C, 80°C, 65°C в течение 15 минут.
Без нагревания.

Ненейтрализованная часть:

Нагревание до 100°C, 80°C, 65°C в течение 15 минут.
Без нагревания.

Исследование прорастания семян кукурузы:

Семена кукурузы отбираются на основе внешнего вида, выбираются крупные и здоровые семена без механических повреждений, и без чернения листьев. Семена затем промываются с использованием 70° спирта в течение 30 секунд, после чего промываются дистиллированной водой.

Штамм бактерий культивируется в колбе, затем добавляют семена и замачивают в каждой пробе:

Пробирка 1: Семена замачивают в нейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 100°C в течение 15 минут.

Пробирка 2: Семена замачивают в ненейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 100°C в течение 15 минут.

Пробирка 3: Семена замачивают в нейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 80°C в течение 15 минут.

Пробирка 4: Семена замачивают в ненейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 80°C в течение 15 минут.

Пробирка 5: Семена замачивают в нейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 65°C в течение 15 минут.

Пробирка 6: Семена замачивают в ненейтрализованной культурной жидкости, нагретой до 65°C в течение 15 минут.

Пробирка 7: Семена замачивают в нейтрализованной культурной жидкости, без нагревания.

Пробирка 8: Семена замачивают в ненейтрализованной культурной жидкости, без нагревания.

Пробирка 9: Семена замачивают в воде. Пробирка 10: Семена не замачивают.

Пробирка 11: Семена замачивают в растворе Carbendazim 0,15%.

Трибат (почва) покупается в садовом центре, после чего стерилизуется при 121°C в течение 20 минут, чтобы удалить бактерии и грибы из почвы.

Затем почва разделяется на одноразовые стаканчики с равным количеством почвы, в каждый стаканчик высаживается 3 семена, для каждой пробы высаживается 36 семян.

Наблюдение за временем прорастания семян, определение процента прорастания, биомассы, стебля, листьев и корней в сравнении с семенами, замоченными в воде и не замоченными.

Исследование влияния культуральной жидькости Lactobacillus sp. с инфицированием грибком Fusarium sp. на прорастание семян кукурузы..

Молочнокислых бактерий размножается в среде MRS Broth при 37°C в течение 24 часов, соотношение инокуляции составляет 5%.

Культуральная жидкость нейтрализуется до pH = 6 с помощью 2N NaOH и без нее:

Нейтрализованная часть:

Нагревание до 100°C, 80°C, 65°C в течение 15 минут.
Без нагревания.
1. Ненейтрализованная часть:
Нагревание до 100°C, 80°C, 65°C в течение 15 минут.
Без нагревания.

Исследование прорастания зёрен кукурузы:

Выбираются зерна кукурузы визуально: большие, здоровые, без механических повреждений, с нечерными проростками. Затем зерна промываются, погружая в 70% спирт на 30 секунд, после чего промываются дистиллированной водой.

Зерна инфицируются грибами Fusarium sp. с площадью 1см² распределения грибка на 1 грамм зерна.

Штамм бактерий размножается в колбе, после чего добавляют зерна кукурузы и выдерживают в каждом экспериментальном условии в течение 30 минут.