Выпускная квалификационная работа (ВКР) на тему "Поиск генетических маркеров и подбор пцр- праймеров для детекции эндогенного вируса perv"

Дипломная работа (ВКР) Тюмгу (Тюменский Государственный Университет). Готовая дипломная работа на тему "Поиск генетических маркеров и подбор пцр- праймеров для детекции эндогенного вируса perv"

Описание работы

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
«ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ
Кафедра экологии и генетики

РЕКОМЕНДОВАНО К ЗАЩИТЕ В ГЭК
Заведующий кафедрой д.б.н., профессор
И. В. Пак
2023 г.

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА
дипломная работа

ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И ПОДБОР ПЦР- ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ЭНДОГЕННОГО ВИРУСА PERV.
06.05.01 Биоинженерия и биоинформатика

Выполнила работу студентка _5_ курса очной формы обучения

Руководитель
Кандидат биологических наук Доцент

Рецензент
Младший научный сотрудник ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора
Тюмень 2023
РЕФЕРАТ

с.50, рис.12, табл. 5, библ. 67.
Было проанализировано 29 геномных последовательностей зоонозного эндогенного ретровируса свиней (PERV), способного заражать клетки человека. Произведено множественное выравнивание последовательностей в программе UGENE алгоритмом выравнивания MUSCLE. Найдено 5 высоконсервативных локусов, подходящих для использования в качестве ДНК маркеров. Из них выделено 3 локуса пригодных для пцр-диагностики. В программе primer-BLAST выполнен дизайн прямых и обратных праймеров для амплификации маркерных локусов и пцр-диагностики.

Ключевые слова: зоооносные вирусы, эндогенный ретровирус свиньи, ксенотрансплантация, пцр, дизайн праймеров, биоинформатика.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАММАРЕТРОВИРУСОВ 7
1.2. СТРОЕНИЕ ГЕНОМА И ФОРМИРОВАНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНДОГЕННОГО ВИРУСА СВИНЕЙ 10
1.3. ИНФИЦИРОВНИЕ ЧЕЛОВЕКА ГАММАРЕТРОВИРУСАМИ 15
1.4. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА PERV 18
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ 24
2.1. БАЗА ДАННЫХ ГЕНОМОВ GENBANK 24
2.2. ИНСТРУМЕНТ ВИЗУАЛИЗАЦИИ UGENE 26
2.3. СЕМЕЙСТВО ПРОГРАММ ДЛЯ АНАЛИЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: BLAST 28
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 32
ВЫВОДЫ 43
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 44

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

CA – белки капсида ENV – ген оболочки
GAG – специфичный для группы антиген LRT – длинные терминальные повторы MA – белки матрицы
NC – белки нуклеокапсида
PERV – эндогенный ретровирус свиней POL – ген полимеразы
SU – белок поверхностной оболочки TM – белок трансмембранной оболочки НТ – нуклеотид
ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

Всё чаще медицина сталкивается с проблемой заболеваний человека, полученных от животных, без известного эффективного лечения [Ludwig, Zarbock, p.93-96], [Monkeypox (mpox) virus…, p. 531-541]. В такой ситуации, чем лучше изучен вирус и проработаны методы его диагностики, тем успешнее можно ограничить его распространение. Среди всех методов диагностики вирусных частиц наиболее оптимальным является ПЦР, поскольку он позволяет быстро, а также высокочувствительно и специфично индентифицировать наличие вирусных элементов [Третьяк, Востокова, Чухловин, p.84-92].
Среди всех животных большую роль играет домашний скот, который также может выступать в качестве резервуара вирусов. В качестве объекта исследования был выбран эндогенный вирус свиней (PERV) в связи возможностью инфицирования человека при ксенотрансплантации [Meije, Tonjes, Fishman, p. 1511–1516]. Трансплантация органов или тканей от одного вида к другому, является областью медицины, которая находится в стадии активной исследовательской работы. Главной особенностью ксенотрансплантации является использование животных, в частности свиней, для предоставления органов и тканей для пересадки людям [Ксенотрансплантация: история, проблемы и перспективы развития, c.37-54].
На данный момент ксенотрансплантация имеет свои ограничения, включая проблемы соответствия иммунной системы и биологических процессов между видами, а также риск передачи инфекций от животного к человеку, один из потенциальных инфекционных агентов является PERV [Мартыненко, с.181-188]. В связи с чем, возникает необходимость разработки инструментов диагностики данного вируса у доноров, в том числе исследование генома вируса для поиска генетических маркеров и дизайн ПЦР праймеров. Разработка маркерных локусов и праймеров является важным шагом в изучении и контроле инфекционных заболеваний, а также открывает

возможности для создания более эффективных диагностических и терапевтических методов [Донченко, Семенихин, с. 71-76].
Цель:
Поиск генетических маркеров и подбор ПЦР-праймеров эндогенного вируса свиней для его специфичной индикации.
Задачи:
- выполнить множественное выравнивание геномных последовательностей исследуемого вируса;
- найти наиболее консервативные участки генома;
- выполнить дизайн праймеров для амплификации маркерных областей.



БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Blusch J. H., Seelmeir S., von der Helm K. Molecular and enzymatic characterization of the porcine endogenous retrovirus protease //Journal of virology. 2002. V. 76, №. 15. P. 7913-7917.
2. Breese S. S. Virus-like particles occurring in cultures of stable pig kidney cell lines //Archiv fur die gesamte Virusforschung. 1970. V. 30, P. 401-404.
3. Carr C. M., Chaudhry C., Kim P. S. Influenza hemagglutinin is spring-loaded by a metastable native conformation // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997. V. 94, № 26. С. 14306-14313.
4. Characterisation of a human cell-adapted porcine endogenous retrovirus PERV-A/C / A. Karlas [et al.] // Annals of transplantation. 2010. V. 15, P. 45-54.
5. Chemiluminescent detection for estimating relative copy numbers of porcine endogenous retrovirus proviruses from Chinese Minipigs based on magnetic nanoparticles / H.Yang [et al.] //Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2016. V. 16, № 6. P. 6505-6510
6. Dean T. T., Serrao V. H. B., Lee J. E. Structure of the Core Postfusion Porcine Endogenous Retrovirus Fusion Protein //Mbio. 2022. V.13, № 1. P. 20-21.
7. Denner J. How active are porcine endogenous retroviruses (PERVs)? // Viruses. 2016. V. 8, № 8. P. 215.
8. Denner J., Tonjes R. R. Infection barriers to successful xenotransplantation focusing on porcine endogenous retroviruses // Clinical microbiology reviews. 2012. V. 25, № 2. P. 318-343.
9. Edgar R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity // BMC bioinformatics. 2004a. V.5, № 1. P. 1-19.
10. Edgar R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput //Nucleic acids research. 2004b. V. 32, № 5. P. 1792-1797.

11. Expression of pig endogenous retrovirus by primary porcine endothelial cells and infection of human cells / U. Martin [et al.] // The Lancet. 1998. V. 352,
№ 9129. P. 692-694.
12. Extended analysis of the in vitro tropism of porcine endogenous retrovirus /
C. A. Wilson [et al.] //Journal of Virology. 2000. V. 74, № 1. P. 49-56.
13. GenBank / D. A. Benson et al. // Nucleic acids research. 2012. V. 41, № 1. P. 36-42.
14. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation / N. Klymiuk, B. Aigner, G. Brem [et al.] // Mol. Reprod. Dev. 2010. V. 77, № 3. P. 209–221.
15. ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses). 2011. Available at http://www.ictvonline. org/virusTaxonomy.asp?bhcp=1
16. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine / D. E. Akiyoshi, M. Denaro, H. Zhu [et al.] // J. Virol. 1998. V. 72, № 5. P. 4503–4507.
17. Identification of receptors for pig endogenous retrovirus / T. A. Ericsson et al. //Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003. V. 100, № 11. P. 6759-6764.
18. Identification of R-peptides in envelope proteins of C-type retroviruses / M. Bobkova [et al.] // Journal of general virology. 2002. V. 83, №. 9. P. 2241- 2246.
19. Infection by porcine endogenous retrovirus after islet xenotransplantation in SCID mice / L.J. van der Laan, C. Lockey, B.C. Griffeth [et al.] // Nature. 2000. V. 407. N 6800. P. 90–94.
20. Kibbe W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic acids research. 2007. V. 35, № 2. P. 43-46.
21. Lavillette D., Kabat D. Porcine endogenous retroviruses infect cells lacking cognate receptors by an alternative pathway: implications for retrovirus evolution and xenotransplantation // Journal of virology. 2004. V. 78, № 16. P. 8868-8877.

22. Ludwig S, Zarbock A. Coronaviruses and SARS-CoV-2: A Brief Overview
// Anesth Analg. 2020. V.131, № 1, P.93-96.
23. Meije Y., Tonjes R.R., Fishman J.A. Retroviral restriction factors and infectious risk in xenotransplantation // Am. J. Transplant. 2010. V. 10. N 7. P. 1511–1516.
24. Monkeypox (mpox) virus: Classification, origin, transmission, genome organization, antiviral drugs, and molecular diagnosis / A. Karagozet al.
//Journal of Infection and Public Health. 2023. V. 16, № 4, P. 531-541.
25. NCBI BLAST: a better web interface / M. Johnson [et al.] // Nucleic acids research. 2008. V. 36, № 2. P. 5-9.
26. Niebert M., Tonjes R. R. Molecular cloning and functional characterization of infectious PERV and development of diagnostic tests //Xeno- transplantation. 2003. V.278, P. 217-237.
27. No evidence of pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys / C. Patience, G. S. Patton, Y. Takeuchi [et al.] // Lancet. 1998. V. 352, P. 699–701.
28. Nomenclature for endogenous retrovirus (ERV) loci / R. J. Gifford, J. Blomberg, J. M. Coffin [et. all] // Retrovirology. 2018. V.15, P. 59.
29. Patience C., Takeuchi Y., Weiss R. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs // Nat Med. 1997. V.3, P. 282–286.
30. PCR past, present and future / Zhu H. [et al.] //Biotechniques. 2020. Т. 69,
№ 4. С. 317-325.
31. Porcine endogenous retrovirus (PERV) molecular structure and replication strategy in the context of retroviral infection risk of human cells / K. Lopata [et al.]. // Frontiers in microbiology. 2018. V. 9, P. 730.
32. Porcine endogenous retrovirus transmission characteristics of an inbred herd of miniature swine / B. A. Oldmixon [et al.] // Journal of virology. 2002. V. 76, № 6. P. 3045-3048.

33. Porcine endogenous retroviruses: in vitro host range and attempts to establish small animal models / V. Specke, S.J. Tacke, K. Boller [et al.] // J. Gen. Virol. 2001. V. 82, № 4. P. 837–844.
34. Pornillos O., Ganser-Pornillos B. K. Maturation of retroviruses // Current opinion in virology. 2019. V. 36, P. 47-55.
35. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction / Ye J. [et al.] //BMC bioinformatics. 2012. Т. 13, С. 1-11.
36. Reddy E. P., Smith M. J., Srinivasan A. Nucleotide sequence of Abelson murine leukemia virus genome: structural similarity of its transforming gene product to other onc gene products with tyrosine-specific kinase activity // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1983. V. 80, № 12. P. 3623-3627.
37. RFLP and microsatellite mapping of a gene for soybean mosaic virus resistance / Y. G. Yu [et al.] // Phytopathology. 1994. V. 84, № 1. P. 60-64.
38. Sayers E. W. et al. GenBank //Nucleic acids research. 2022. Т. 50, № 1. С. 161.
39. Scobie L., Takeuchi Y. Porcine endogenous retrovirus and other viruses in xenotransplantation // Curr. Opin. Organ Transplant. 2009. V. 14, № 2. P. 175–179.
40. Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue / K. Paradis, G. Langford, Z. Long, [et al.] // Science. 1999. V. 285, P. 1236–1241.
41. Specke V., Rubant S., Denner J. Productive infection of human primary cells and cell lines with porcine endogenous retroviruses // Virology. 2001. V. 285,
№ 2. P. 177-180.
42. Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses / W. Weissenhorn [et al.] // Molecular membrane biology. 1999. V. 16, № 1. P. 3-9.
43. Two sets of human-tropic pig retrovirus / P. Le Tissier, J. Stoye, Y. Takeuchi, [et al.] // Nature. 1997. V.389, P. 681-682.

44. Type C retrovirus released from porcine primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells / C. A. Wilson [et al.] // Journal of virology. 1998. V. 72, № 4. P. 3082-3087.
45. Ultrasensitive detection and subtyping of porcine endogenous retrovirus provirus based on magnetic nanoparticles and chemiluminescence / H. Yang [et al.] // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2015. V. 15, № 8. P. 5597-5604.
46. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit / K. Okonechnikov et al. // Bioinformatics. 2012. V. 28, № 8. P. 1166-1167.
47. ViralZone: a knowledge resource to understand virus diversity / C. Hulo, E. de Castro, P. Masson [et al.] // Nucleic Acids Res. 2011. V.39, P. 576-582.
48. Ye J., McGinnis S., Madden T. L. BLAST: improvements for better sequence analysis //Nucleic acids research. 2006. Т. 34, № 2. С. 6-9.
49. Zhao K., Chu X. G-BLASTN: accelerating nucleotide alignment by graphics processors //Bioinformatics. 2014. Т. 30, № 10. С. 1384-1391.
50. Алексеева А.E., Бруснигина Н.Ф. Возможности и перспективы применения методов массивного параллельного секвенирования в диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями // Журнал МедиАль. 2014. №2 C.12.
51. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных) / Д. А. Чемерис [и др.] // Биомика. 2016. Т. 8, № 3. С. 215-238.
52. Долгов В. В. Клиническая лабораторная диагностика. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2012. Т.2. 808 с.
53. Донченко А. С., Семенихин В. И. Области применения ДНК-маркеров при инфекционных болезнях животных (обзор) //Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2008. № 6. С. 71-76.
54. Конструирование праймеров для ПЦР в программе Primer-BLAST / А. А. Козырева, А. М. Злотина, А. С. Головкин [и др.] // Трансляционная медицина. 2021. Т.8, С. 37-52.

55. Ксенотрансплантация: история, проблемы и перспективы развития / Гуляев В. А. [и др.] //Трансплантология. 2019. Т. 11, № 1. С. 37-54.
56. Мартыненко Н. А. Свинья как модель в биомедицинских исследованиях. Ксенотрансплантация (обзор) //Вісник Полтавської державної аграрної академії. 2006. № 2, С. 181-188.
57. Набиева Ф. С., Душанова Г. А., Бобокулов О. О. Значение иммуноферментного анализа в диагностике инфекционных заболеваний
// Вестник науки и образования. 2021. №. 107. С. 54-56.
58. Носик Н. Н., Стаханова В. М. Лабораторная диагностика вирусных инфекций // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2000. Т. 2, №. 2. С. 70-78.
59. Попкова М. И., Уткин О. В. Генетическое разнообразие вируса Эпштейна-Барр: современный взгляд на проблему //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022. № 1. С. 93- 108.
60. ПЦР «в реальном времени» / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов [и др.] // М: БИНОМ. Лаборатория Знаний. 2009. Т.115, С. 223
61. ПЦР-диагностика респираторных вирусных инфекций / А. А. Мухина [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 6. С. 51-55.
62. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора / Р. Р. Гарафутдинов [и др.] // Биомика. 2019. Т. 11, № 1. С. 23-70.
63. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения
// Усп. соврем. биологии. 2004. Т. 124, С. 260–271
64. Третьяк А. Т., Востокова Л. П., Чухловин А. Б. Роль и место ДНК- диагностики в инфекционной клинике // Педиатр. 2013. Т. 4, № 4. С. 84-
92.
65. Учайкин В. Ф. Диагностика инфекционных болезней на современном этапе // Детские инфекции. 2005. Т. 4, № 4. С. 3-6.

66. Чирков А. А., Петрова О.Г. Современные методы диагностики инфекционных заболеваний свиней // Молодежь и наука. 2017. № 1. С. 73.
67. Юдин, Н. С., Айтназаров Р.Б., Ермолаев В. И. Эндогенные ретровирусы свиньи: насколько велик риск инфекции при ксенотрансплантации? // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15, № 2. С. 340-350.