Дипломная работа на тему "ТЮМГУ | Получение штамма e | coli - продуцента кислой переплазматической фитазы"

Работа на тему: Получение штамма e.coli - продуцента кислой переплазматической фитазы
Оценка: хорошо.
Оригинальность работы на момент публикации 50+% на антиплагиат.ру.
Ниже прилагаю все данные для покупки.
https://studentu24.ru/list/suppliers/Anastasiya1---1326

Описание работы

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
"ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ
Кафедра экологии и генетики

РЕКОМЕНДОВАНО К ЗАЩИТЕ В ГЭК
Заведующий кафедрой

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА
специалиста
ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА E.coli - ПРОДУЦЕНТА КИСЛОЙ ПЕРЕПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ФИТАЗЫ

06.05.01 Биоинженерия и биоинформатика

Тюмень 2022

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 ФИТИНОВАЯ КИСЛОТА 8
1.2 РОЛЬ ФИТАТОВ И ИХ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ОРГАНИЗМЫ И экологию 9
1.3 КЛАССЫ И ПРИНЦИП РАБОТЫ ФИТАЗ 12 ПТИЦЕВОДСТВА 15
1.5 ПРИМЕНЕНИЕ ФИТАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ 18
1.6 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФИТАЗ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И МЕДИЦИНЕ 20
1.7 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦИЕНТОВ ФИТАЗЫ 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 23
2.2 ШТAММЬI Е. COLI 24
2.3 ПЛАЗМИДА АРРА 24
2.4 ТРАНСФОРМАЦИЯ Е. COLI BL2l(DE3) 6
2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА И ЕГО ОЧИСТКА 27
2.6 ФЕНОЛЬНАЯ ДЕПРОТЕИНИЗАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 29
2.7 СПИРТОВОЕ ОСАЖДЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 29
2.8 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ 29
2.9 ИНДУЦИРОВАННЫЙ БИОСИНТЕЗ БЕЛКА 30
2.10 ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ИЗ ПЕРИПЛАЗМЬI КЛЕТОК Е. COLI 30
2.11 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИЗМЕРЕНИЕ БЕЛКА ПО БРЕДФОРДУ 31
2.12 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ 31
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 34
3.1 ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦИЕНТА КИСЛОЙ ПЕРИПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ФИТАЗЫ (АРРА) 34
3.2 ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ПЛАЗМИДЫ РАРРА 35
3.3 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА КИСЛОЙ ПЕРИПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ФИТАЗЫ (АРРА) 36
выводы 40
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 41

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АА - акриламид
ДНК - 2'-дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецил сульфат натрия
ДТТ - дитиотрейтол
МБАА - метиленбисакриламид ПААГ - полиакриламидный гель ПСА - персульфат аммония
ТЕМЕД - N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин трис - трисоксиметиламинометан
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота IPTG - изопропилтиогалактопиранозид
X- gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил- -D-галактозид

РЕФЕРАТ
С.45,табл.5,библ.42.
Работа направлена на создание модифицированного штамма кишечной палочки - продуцента кислой преиплазматической фитазы. Получен штамм Е. coli с повышенным уровнем экспрессии гена кислой периплазматической фитазы. Получен высокоочищенный препарат плазмидной ДНК, содержащей ген кислой периплазматической фитазы. Произведен индуцированный биосинтез кислой периплазматической фитазы в клетках Е. coli.
Ключевые слова: фосфор, фитиновая кислота, фитаты, кислая перплазматическая фитаза, АррА, экспрессия гена, биосинтез белка, Е. co/i.

ВВЕДЕНИЕ
Одним из макроэлементов клетки является фосфор. Его нехватка или отсутствие сказывается на каскаде обменных процессов. Так, например, фосфор является неотъемлемым компонентом нуклеиновых кислот, макроэргических молекул, фосфолипидов, коферментов, ферментных белков, гормонов и многих других веществ. Не стоит забывать, что этот простой элемент активно участвует в энергетическом обмене, выполняет функцию буфер в крови и напрямую связан со структурной основой костной ткани.
Однако его содержание в организме не должно выходить за рефератные значения, то есть плох как избыток, так и недостаток. При недостатке фосфора отмечается снижение аппетита, задержка роста и развития у животных. В тоже время при избытке фосфора происходит снижение способности к усвоению кальция, что приводит к вымыванию минеральной составляющей костей, развитию рахита.
Применение фосфатаз в производстве кормов для сельскохозяйственного скота, позволит последним извлекать больше питательных веществ и соединений из кормов. Что благоприятно скажется на экономических и экологических аспектах производства.
В растениях две трети фосфора находится в форме фитат (кальциевые и магниевые соли инозитолгесафосфорной кислоты), гетеротрофные организмы способны усвоить в полной мере только «свободную» треть которая представлена неорганическим фосфором. Это связанно с недостатком или отсутствием в жкт фитатдеградирующих ферментов. Фитаты несут отрицательный заряд и способны связывать положительно заряженные ионы (железо, кальций, цинк). Так же присутствует проблема выделения животными неусвоенного фосфора, что в свою очередь приводит к эвтрофикации водоемов.
Фитиновая кислота и ее соли - фитаты, являются основной и наиболее встречающейся формой органического фосфора в почве [Mullen, M.D].
Как итог биотехнологии и ученные обратили свое внимание на фитазы как способ борьбы с труднодоступностью фосфора и возможностью разработки методик и технологий по применению этих ферментов в животноводстве, сельском хозяйстве и охране окружающей среды.
Цель работы:
Создание модифицированного штамма кишечной палочки - продуцента кислой преиплазматической фитазы.
Исходя из намеченной цели, были поставлены следующие задачи:
1. Получить штамм Е. coli с повышенным уровнем экспрессии гена кислой периплазматической фитазы.
2. Получить высокоочищенный препарат плазмидной ДНК, содержащей ген кислой периплазматической фитазы.
3. Осуществить индуцированный биосинтез кислой периплазматической фитазы в клетках Е. coli.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ crrncoк
1. Anderson R. J. А contribution to the chemistry of ph.ytin // Joumal 0f Biological Chemistry. 1914. V. 17. Р. 171-190.
2. Arie К. Phytase studies in pigs and poultryEffect on protein digestion and energy utilization // Doctoral thesis, Wageningen Institute of Animal Sciences, Wageningen University, The Netherlands. 2005. Р. 6-14.
3. Beckwith J., Boyd, The nonconsecutive disulfide bond of Escherichia с li phytase (АррА) renders it dependent on the protein-disulfide i:юmerase, DsbC. // Protein synthesis, post-translation modification, and degradation. 2005. V. 280. Р.11387-11394.
4. Brown Е. С., Heit М. L., Ryan D. Е. Phytic acid - Anal)'1:ical investigation // Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne de Chimie. 1961. V. 39, N. 6. !Р. 1290-1297.
5. Cheryan М., Rackis J. Phytic acid interactions in food systems // Taylor and Francis Online. 2009. V.13 Р. 6-7.
6. Chu, G.M. Dietary phytase increases the true absorption anrd endogenous fecal excretion of zinc in growing pigs given а com-soy bean meal based // Anim. Sci. J. 2009. V. 80. № 1. Р. 46-51.
7. Mullen, M.D. Phosphorus in soil: Ьiological interactions // Encyclopedia of Soils in the Environment. - Oxford: Elsevier Ltd. 2005. Р. 210--215.
8. Fugthong, А. Biochemical characterization and in vitro digestibШty assay of Eupenicillium parvum (BCCl 7694) phytase expressed in Pichia pastoris // Prot. Expression and Purification. 2010. V. 70. Р. 60 - 67.
9. Nunes C.S., Kumar V. Enzymes in Human and Animal N11trition // Academic Press. 2018. Р. 54-67.
10. Guzman LM., Belin D., Carson М. J., Beckwith J.. Tight regulation,
modulation, and high-level expression Ьу vectors containing tЬе araЫnose PBAD promoter // Received 6 February. 1995. V. 177. N. 14. Р. 4121--4124.
11. House А., Ross Welch М., Daпell Effect R. of Phytic Acid on the Absorption, Distribution, and Endogenous Excretion of Zinc in RatsWilliam // Van CampenThe Joumal ofNutrition. 1982. V. 112 Р. 941-953.
12. Johnson, L.F., Tate М. Е., Structure of 'ppBntic acids" // Department of
Agricultural Biochemisfrj, Waite Agricultural Research Zizsfitute, Unicersity of Adelaide, South Australia, Australia Received. 1968. Р. 63-65.
13. Komegay Е.Т., Bedford M.R., Partridge G. Digestion of ph.osphorus and other nutrients: the role of phytases and factors influencing the:ir activity// СВА Intemational. 2001. V. 1. Р. 238-242.
14. Lei, X.G. Phytase: sourse, structure and application // Iпdustrial Enzymes. 2007. Р. 505-529.
15. Lennox E.S., Transduction of Linked Genetic Characters of the host Ьу
bacteriophage. 1955. Р. 4-14.
16. Makarewicz, О. Dual role of the PhoP approximately Р response regulator: Bacillus amyoliquefaciens FZB45 phytase gene transcription direc;ted Ьу positive and negative interaction with the phy С promoter // J. Bacteriol. 2006. V. 188. Р. 6953- 6965.
17. Nivanjana. S.R., Hariprasad Р. Isolation and characterization of phosphate soluЬilizing rhizobacteria to improve plant health of tomato // Plant Soil. 2009. V. 316.Р.13-24.
18. Pallauf J. Rimbach G. Institute of Animal Nutrition and Nu1:rition Physiology // Taylor and Francis Online. 2009. V.13. Р. 301-319.
19. Ravindran V., Peter S. Protein and energy effects of microЬial phytase in poultry diets // Faculty of Veterinary Science, The University of Sydney, Camden, NSW 2750, Australia. 2006. V.135. Р.18-24.
20. Richardson, А.Е. Utilization of soil organic phosphorus Ьу higher plants // Organic phosphorus in the environment. Wallingford. UK: CABI PuЫishing, 2005. Р. 165-184.
21. Sanz-Penella, J.М. Application of Ьifidobacterial phytases in infant cereals: effect on phytate contents and mineral dialyzaЬility // J. Aqric Food Chem. 2012. V. 60. № 47. Р. 11787-11792.
22. Singh М., Кrikorian А. D. InhiЬition of trypsin activity in vitro Ьу phytate //
Food Chem. 1982. V.30. Р. 799-800
23. Shamsudding, М., Vucenik 1. IP6 and inositol in cancel preYention and therapy// Cur. Cancer Therapy Rec. 2005. V. 1. Р. 259-269.
24. Volkmann С. J High-resolution isotope measuremeпts resolve rap1d ecohydrological dynamics at the soil-plant interface // New Phytologist Trust. 2002. V.210. Р. 839-842 1
25. Yasutoyo N., Saburo F. Phytase (myoinositolhexaphosphate
phosphohydrolase) // Department of Agricultural Chemistry, the Lrniversity of То Tokyo Received 1962. V.26. Р. 803.
26. Zhao, W. High level expression of an acid-staЫe phytase from Citrobact r freundii in Pichia pastoris // Appl. Biochem. Biotechnol. 2010. V. 162. № 8. Р. 215 - 2165.
27. Анчиков Э. Использование фитазы в комбикормах для свиней и птицы// Сельскохозяйственная биология. 2008. №. 4. С. 3-14.
28. Анчиков Э., Селле. Новый взгляд на применение фитазы в рацион бройлеров// Сельскохозяйственная биология. 2017. №. 10. С. 71-72.
29. Ахметова А.И., Мухаметзянова А.Д., Шарипова М.Р. микробные фитазы как основа новых технологий в кормлении животных // Ученые запись и казанского университета. 2012. Т.4. С. 108-109.
30. Балаболкин М.И. «Эндокринология» // «Универсум паблишинг». 1998. Т.1. С. 243-248.
31. Верещагин, Д. Новые технологии в кормлении свиней / Д. Верещагин // МКМ, Свиноводство. 2006. спецвыпуск №1.
32. Гаскарова О.В. Перспективы использования фитиновой кис:лоты как биологически-активной добавки растительного происхождения I в
косметических средствах// Проектная культура и качество жизни. 2018. №. 10. с. 47-52.
33. Евтыхова Е. Б., Балтабекова, А. Ж., Силаев Д. В., Шустов А. В. Разработка технологической платформы для получения синт,етической фитазы в бактериальных системах экспрессии// Беларуская наука « ,1инск». 2013. Т.б.
с. 54-57.
34. Мухаметзянова А.Д., Ахметова А.И., Шарипова М.Р. Микроорганизмы как продуценты фитаз // Микробиология. 2012. Т. 81, №3. С. 291-300.
35. Подобед, Л.И., Пархоменко А.А. Вопросы практического применения фитаз в качестве факторов повышения питательности рационов и экономии энергетического пространства в их составе// Энзимология. 2007. Т. 4. С. 11-16.
36. В.А. Савинов, Е.В. Самбук, М.В. Падкина Природные и рекомбинантные
фитазы микроорганизмов. ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. 2007. Т.3. С. 66-75.
37. Сердюк Е.Г. Активность нейтральной фитазы из obesшnbacteriнm proteus в рекомбинантных штаммах дрожжей yarrowia lipolytica при культивировании на низкосортных растительных субстратах/. Е. Г. Сердюк, Е. П. Исакова, Н. Н. Гесслер, Е. В. Трубникова, А. Н. Антипов, Ю. И. Дерябина // Прикладн биохимия и микробиология. 2019. Т.55. С. 498-505.
38. Сулейманова А. Д. Гистидиновая кислая фитаза pantoea. vаgаns:выделение и свойства// Казань. 2003. С. 19-23.
39. Краснопольский Ю. М. Фармацевтическая биотехнология: производство биологически активных веществ// НТУ "ХПИ". 2012. Т. 1. С. 328-331.
40. Кузьминчук А. В. Фосфаты в воде.// ТНВ,В и ОХТ НГУУ "КПИ". 2019.
№. 4. с. 4-6.
41. Честухина Г. Г. Способ выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами saccharomyces cerevisiaE: // ФГУП ГосНИИГенетика. 2011. №.7. С. 19-22.
42. Юшин Ю.В. Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной escherichia coli / Ю.В. Юшин, // Коллектив Авторов. 2019. 21. с. 446-447.